· poliakryloamidmoszcz żelowy składający się z monomeru akryloamidu, materiału wyjściowego do polimeryzacji, katalizatora i mieszaniny soli i buforu.
· akrylamidi BIS (N,N'-metylenopodwójny akryloamid) jest matrycą żelową w postaci monomeru.
· Nadsiarczan amonu rozpoczyna proces polimeryzacji kleju. Receptura kleju wymaga 10% roztworu nadsiarczanu amonu przygotowanego w wodzie. Większość informacji wskazywała na potrzebę aktywnego stosowania. Jednakże 10% roztwór można umieścić w temperaturze 4°C na kilka tygodni bez znaczącej utraty aktywności. Uzupełnić do 10 ml i wyrzucić, gdy klej nie zwiąże się.
Wskazówka: procentakrylamidw sekwencjonowaniu kleju i kleju białkowego to nie to samo. Jeśli używasz gotowego roztworu akrylamidu: BIS, upewnij się, że zaopatrzyłeś się w odpowiednią butelkę.
· TEMED (N, N, N', N'-tetrametyloetylenodiamina) to katalizator w brązowej butelce, umieszczony w lodówce. Dodać tuż przed wylaniem kleju.
· Szkło stosowane w elektroforezie poliakryloamidowej należy myć przed i po każdym zabiegu. Po elektroforezie umyć miękką szczoteczką i szmatką w gorącej wodzie z mydłem, spłukać wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia.
· Wilgoć i kurz mogą powodować wydrążony polimer. Przed elektroforezą należy oczyścić płytkę szklaną środkiem do czyszczenia szkła i przetrzeć ją miękką szczoteczką. Umyć wodą destylowaną i dokładnie osuszyć papierową chusteczką. Płukanie 70% etanolem przed przetarciem papierem pomaga oczyścić i przyspieszyć suszenie. Dodawać kolejno próbki akryloamidu: BIS, woda, roztwór buforowy, nadsiarczan amonu, TEMED. Dobrze wstrząśnij i natychmiast wlej.
Nie jest konieczne odgazowanie poliakryloamidu przed polimeryzacją. (Akryloamid był kiedyś umieszczany w próżni w celu usunięcia pęcherzyków, ponieważ tlen hamuje polimeryzację.)
Próbki poziomych punktów klejenia.
· włóż do dolnego pudełka kawałek czarnego papieru, czarne tło, aby zrobić próbny otwór, aby widzieć wyraźniej.
· Bufor wypełniony zbiornikiem kleju, tuż nad koloidem.
· jeśli krawędź ma światło, włącz światła, pozwól, aby światło świeciło koloidem. Pobrać próbkę do pipety.
· przy użyciu automatycznego urządzenia do pipetowania.
· w 10-200 μl można zastosować 1 płynny punkt ruchomy w większości punktów próbki. W przypadku bardzo małych otworów na próbki (mniejszych niż 10 μ1) wygodniejsza jest długa głowica pipety używana do kleju sekwencyjnego.
· Pipetując jedynie zanurzając się w próbce, wdychając wolno poruszający się płyn. Próbka może sprawiać wrażenie lepkiej od gliceryny, a szybkie pompowanie może spowodować wciągnięcie pęcherzyków powietrza do główki pipety.
· próbki po wdychaniu głowicy pipetującej delikatnie przesuną głowicę cieczy na krawędź rury lub wycierając papierem, wyssają głowicę cieczy poza kropelki. Uważaj, aby nie zassać próbki.
Umieść próbkę w otworze próbki
· Urządzenie do pipetowania, aby utrzymać niewielkie ciśnienie, sprawić, że próbki lekko przesuną się nad głową cieczy przelewowej.
· Głowica pipetująca umieszczona w buforze, nieco wyżej niż otwory punktowe, utrzymuje nadciśnienie. Końcówkę pipety można włożyć w mały otwór.
· Powoli i równomiernie pobieraj próbki. Końcówkę pipety umieszcza się nad punktowym otworem na próbkę, a próbka zagłębia się w otworze. Pozwól, aby próbka opadła, aby wypełnić otwór próbki, zamiast wciskać ją.
· po ostatniej kropli próbki z głowicą cieczy, ciecz przesunie się do drugiej nogi, powoli podniesie ruch cieczy, wyjdzie z bufora
Jak pobrać próbki kleju pionowego?
· pionowe otwory na próbki punktów klejenia utworzone pomiędzy dwoma kawałkami szkła. W przypadku bardzo rzadkiego kleju głowicy pipety nie można nawet włożyć pomiędzy dwie szklane płytki. Uważaj na glicerynę! Umieść głowicę pipety nad otworem próbki, a próbka zanurzy się w otworze.
· Punkt próbki wcześniej, pamiętaj o ustawieniu pionowego punktu otworu na próbkę żelu polipropylenowo-acylowego i wypłukaniu go do czysta. Zmyć niespolimeryzowany akryloamid i wodę, która może pojawić się na dnie otworu próbki. Woda może znacznie zmniejszyć otwór próbki. Użyj strzykawki o pojemności 25 ml lub 50 ml i igły o rozmiarze 18. Wlać bufor do elektroforezy i ostrożnie przepłukać otwór próbki.
· Dostrzeżenie otworu próbki może być trudne, ale reszta jest łatwa. W przypadku nadmiaru dziur bufor próbki można przetestować za pomocą błękitu bromofenolowego.
Czas publikacji: 31 marca 2023 r