· poliakrylamidżel musi być łączony przez monomer akrylamidu, materiał wyjściowy polimeryzacji, katalizator oraz odpowiednią mieszaninę soli i buforu.
· akrylamida BIS (N, N'-metyleno-podwójny akrylamid) jest monomerem w postaci matrycy żelowej.
· nadsiarczan amonu rozpoczyna proces polimeryzacji kleju. Formuła kleju wymaga 10% roztworu nadsiarczanu amonu przygotowanego w wodzie. Większość informacji wskazywała na potrzebę aktywnego stosowania. Jednak 10% roztwór można umieścić w temperaturze 4℃ na kilka tygodni bez znaczącej utraty aktywności. Uzupełnij do 10 ml i wyrzuć, gdy klej nie będzie się agregował.
Wskazówka: Procentakrylamidw sekwencjonowaniu klej i klej białkowy nie są tym samym. Jeśli używasz gotowego akrylamidu: roztworu BIS, upewnij się, że masz odpowiednią butelkę.
· TEMED (N, N, N ', N'- tetrametyloetylenodiamina) to katalizator, w brązowej butelce, umieszczony w lodówce. Dodaj tuż przed wlaniem kleju.
· elektroforeza poliakrylamidowa szkło używane w elektroforezie powinno być myte przed i po każdym zabiegu. Po elektroforezie umyj miękką szczotką i szmatką w gorącej wodzie z mydłem, spłucz wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia.
· wilgoć i kurz mogą powodować w przypadku polimeru pustego. Przed elektroforezą wyczyść płytkę szklaną płynem do czyszczenia szkła i wytrzyj ją miękką szczotką. Umyj wodą destylowaną i dokładnie osusz papierowym ręcznikiem. Płukanie 70% etanolem przed przetarciem papierem pomaga oczyścić i przyspieszyć suszenie. Dodawaj próbki akrylamidu kolejno: BIS, wodę, roztwór buforowy, nadsiarczan amonu, TEMED. Dobrze wstrząśnij i natychmiast wlej.
Nie ma konieczności odgazowywania poliakrylamidu przed polimeryzacją. (Akrylamid był dawniej umieszczany w próżni w celu usunięcia pęcherzyków, ponieważ tlen hamuje polimeryzację.)
Przykładowe końcówki do klejenia poziomego.
· włóż kawałek czarnego papieru do dolnego pudełka, czarne tło pozwoli zrobić otwór i będzie lepiej widać.
· zbiornik z klejem wypełniony buforem, tuż nad koloidem.
· jeśli krawędź ma światło, włącz światła, pozwól światłu świecić koloidem. Wciągnij próbkę do pipety.
· za pomocą automatycznego urządzenia pipetującego.
· w 10-200 mu 1 punkt ruchomy cieczy może być używany w większości punktów na próbce. W przypadku bardzo małych otworów próbki (mniej niż 10μ1) wygodniejsza jest długa głowica pipety używana do sekwencjonowania kleju.
· pipetowanie zanurzone w próbce, wdychanie powoli poruszającego się płynu. Próbka może wydawać się lepka z gliceryną, a szybkie pompowanie może wciągnąć pęcherzyki powietrza do głowicy pipety.
· próbki po wdychaniu głowicy pipetującej, będą delikatnie przesuwać głowicę cieczy na krawędzi rury lub papier ścierny zasysa głowicę cieczy poza krople. Uważaj, aby nie zassać próbki.
Umieść próbkę w otworze na próbkę
· urządzenie pipetujące, aby utrzymać niewielkie ciśnienie, powodując delikatne przemieszczanie się próbek nadmiaru cieczy w głowicy.
· głowica pipetująca włożona do bufora, nieco wyżej niż otwory punktowe, utrzymuje dodatnie ciśnienie. Końcówkę pipety można włożyć do małego otworu.
· powoli i równomiernie wyjmij próbki. Końcówka pipety jest umieszczona nad punktem otworu próbki, a próbka zatonie w otworze. Pozwól próbce zatonąć, aby wypełnić otwór próbki, zamiast wpychać ją.
· gdy ostatnia kropla próbki znajdzie się w cieczy, ciecz przesunie się do drugiej odnogi, powoli podnosząc ruch cieczy, wysuwając się z bufora
Jak wykonać pionowe pobieranie próbek kleju?
· pionowe otwory na próbki kleju utworzone między dwoma kawałkami szkła. W przypadku bardzo cienkiego kleju głowica pipety nie może być nawet włożona między dwie szklane płytki. Uważaj na glicerynę! Umieść głowicę pipety nad otworem na próbkę, a próbka zatonie w otworze.
· punktowa próbka przed, upewnij się, że pionowy punkt polipropylenowego żelu acylowego otwór próbki jest wypłukany do czysta. Zmyj niespolimeryzowany akrylamid i wodę, która może pojawić się na dnie otworu próbki. Woda może znacznie zmniejszyć otwór próbki. Użyj strzykawki 25 ml lub 50 ml i igły 18-gauge. Wlej bufor do elektroforezy i ostrożnie przepłucz otwór próbki.
· trudno jest zobaczyć otwór próbki, ale reszta jest łatwa. Jeśli jest nadmiar otworów, bufor próbki można przetestować błękitem bromofenolowym.
Czas publikacji: 31-03-2023