· poliakryloamidmoszcz żelowy składający się z monomeru akryloamidu, materiału wyjściowego do polimeryzacji, katalizatora i mieszaniny soli i buforu.
· akryloamidi BIS (N,N'-metylenopodwójny akryloamid) jest matrycą żelową w postaci monomeru.
· Nadsiarczan amonu rozpoczyna proces polimeryzacji kleju.Receptura kleju wymaga 10% roztworu nadsiarczanu amonu przygotowanego w wodzie.Większość informacji wskazywała na potrzebę aktywnego stosowania.Jednakże 10% roztwór można umieścić w temperaturze 4°C na kilka tygodni bez znaczącej utraty aktywności.Uzupełnić do 10 ml i wyrzucić, gdy klej nie zwiąże się.
Wskazówka: procentakryloamidw sekwencjonowaniu kleju i kleju białkowego to nie to samo.Jeśli używasz gotowego roztworu akrylamidu: BIS, upewnij się, że zaopatrzyłeś się w odpowiednią butelkę.
· TEMED (N, N, N', N'-tetrametyloetylenodiamina) to katalizator w brązowej butelce, umieszczony w lodówce.Dodać tuż przed wylaniem kleju.
· Szkło stosowane w elektroforezie poliakryloamidowej należy myć przed i po każdym zabiegu.Po elektroforezie umyć miękką szczoteczką i szmatką w gorącej wodzie z mydłem, spłukać wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia.
· Wilgoć i kurz mogą powodować wydrążony polimer.Przed elektroforezą należy oczyścić płytkę szklaną środkiem do czyszczenia szkła i przetrzeć ją miękką szczoteczką.Umyć wodą destylowaną i dokładnie osuszyć papierową chusteczką.Płukanie 70% etanolem przed przetarciem papierem pomaga oczyścić i przyspieszyć suszenie.Dodawać kolejno próbki akryloamidu: BIS, woda, roztwór buforowy, nadsiarczan amonu, TEMED.Dobrze wstrząśnij i natychmiast wlej.
Nie jest konieczne odgazowanie poliakryloamidu przed polimeryzacją.(Akryloamid był kiedyś umieszczany w próżni w celu usunięcia pęcherzyków, ponieważ tlen hamuje polimeryzację.)
Próbki poziomych punktów klejenia.
· włóż do dolnego pudełka kawałek czarnego papieru, czarne tło, aby zrobić próbny otwór, aby widzieć wyraźniej.
· Bufor wypełniony zbiornikiem kleju, tuż nad koloidem.
· jeśli krawędź ma światło, włącz światła, pozwól, aby światło świeciło koloidem.Pobrać próbkę do pipety.
· przy użyciu automatycznego urządzenia do pipetowania.
· w 10-200 μl można zastosować 1 płynny punkt ruchomy w większości punktów próbki.W przypadku bardzo małych otworów na próbki (mniejszych niż 10 μ1) wygodniejsza jest długa głowica pipety używana do kleju sekwencyjnego.
· Pipetując jedynie zanurzając się w próbce, wdychając wolno poruszający się płyn.Próbka może sprawiać wrażenie lepkiej od gliceryny, a szybkie pompowanie może spowodować wciągnięcie pęcherzyków powietrza do główki pipety.
· próbki po wdychaniu głowicy pipetującej delikatnie przesuną głowicę cieczy na krawędź rury lub wycierając papierem, wyssają głowicę cieczy poza kropelki.Uważaj, aby nie zassać próbki.
Umieść próbkę w otworze próbki
· Urządzenie do pipetowania, aby utrzymać niewielkie ciśnienie, sprawić, że próbki lekko poruszą się nad głowicą cieczy przelewowej.
· Głowica pipetująca umieszczona w buforze, nieco wyżej niż otwory punktowe, utrzymuje nadciśnienie.Końcówkę pipety można włożyć w mały otwór.
· Powoli i równomiernie pobieraj próbki.Końcówkę pipety umieszcza się nad punktowym otworem na próbkę, a próbka zagłębia się w otworze.Pozwól, aby próbka opadła, aby wypełnić otwór próbki, zamiast wciskać ją.
· po ostatniej kropli próbki z głowicą cieczy, ciecz przesunie się do drugiej nogi, powoli podniesie ruch cieczy, wyjdzie z bufora
Jak pobrać próbki kleju pionowego?
· pionowe otwory na próbki punktów klejenia utworzone pomiędzy dwoma kawałkami szkła.W przypadku bardzo rzadkiego kleju głowicy pipety nie można nawet włożyć pomiędzy dwie szklane płytki.Uważaj na glicerynę!Umieść głowicę pipety nad otworem próbki, a próbka zanurzy się w otworze.
· Punkt próbki wcześniej, pamiętaj o ustawieniu pionowego punktu otworu na próbkę żelu polipropylenowo-acylowego i wypłukaniu go do czysta.Zmyć niespolimeryzowany akryloamid i wodę, która może pojawić się na dnie otworu próbki.Woda może znacznie zmniejszyć otwór próbki.Użyj strzykawki o pojemności 25 ml lub 50 ml i igły o rozmiarze 18.Wlać bufor do elektroforezy i ostrożnie przepłukać otwór próbki.
· Dostrzeżenie otworu próbki może być trudne, ale reszta jest łatwa.W przypadku nadmiaru dziur bufor próbki można przetestować za pomocą błękitu bromofenolowego.
Czas publikacji: 31 marca 2023 r